Amikor éppen végzett, és belépett a munkába, egy csomó főnévvel kell szembenéznie, amelyek valós idejű kvantitatív PCR-kísérletekkel néznek szembe. Tanácstalan vagy, hogy hol kezdjem? Mit jelent az amplifikációs görbe, a standard görbe, a küszöb, a CT-érték, az olvadási görbe és az alapvonal? A kísérletekből származó fluoreszkáló képek túl világosak, de úgy tűnik, nem tudom azonosítani őket. Ma ezeket az ismereteket és fogalmakat két részben ismertetjük: szakkifejezésekkel és gyakran ismételt kérdésekben.
I. rész Szakmai feltételek
1. Erősítési görbe
Az amplifikációs görbe arra a görbére vonatkozik, ahol a ciklus száma az abszcissza, és a valós idejű fluoreszcencia intenzitás a reakció során az ordináta a PCR során.
2. Alapállapot
Az alapvonal a fluoreszcens jel csekély változására utal a PCR amplifikációs reakció első néhány ciklusa során. A jelszint egy egyenes vonal közelében mutat, ami az alapvonal.
3. Fluoreszcencia küszöb beállítása
Jellemzően a PCR reakció első 15 ciklusának fluoreszcencia jelét használják fluoreszcencia háttérjelként, és a fluoreszcencia küszöb a fluoreszcencia jel szórásának 10-szerese a PCR 3-15 ciklusai során, és a fluoreszcencia küszöb a PCR amplifikáció exponenciális fázisában van beállítva. Általában minden műszernek megvan a saját fluoreszcencia küszöbe használat előtt.
4. CT-érték
A CT-érték azoknak a ciklusoknak a számát jelenti, amelyek az egyes PCR-reakciócsöveknél előfordulnak, amikor a fluoreszcens jel eléri a beállított küszöböt. A kutatásból tudjuk, hogy lineáris kapcsolat van az egyes sablonok CT értéke és az adott sablon kezdő példányszámának logaritmusa között. Minél nagyobb a kezdeti másolatszám, annál kisebb a CT-érték, és fordítva. Ismert kezdő kópiaszámú standardok felhasználásával kalibrációs görbe készíthető, ahol az abszcissza a kezdő példányszám logaritmusát, míg az ordináta a CT értéket jelenti. Ezért mindaddig, amíg az ismeretlen minta CT-értékét megkapjuk, a minta kezdeti példányszáma kiszámítható a standard görbéből.
többet tud
Számos mutató van annak megítélésére, hogy az erősítési görbe jó-e vagy sem:
Válasz: A görbe inflexiós pontja nyilvánvaló, különösen a kis tömegű frakció minta exponenciális fázisa nyilvánvaló, az amplifikációs görbe általános párhuzamossága nagyon jó, az alapvonal lapos, nincs emelkedő jelenség, és az erősítés Az alacsony szintű exponenciális fáziskoncentráció minta görbéje nagyon jó. nyilvánvaló.
B: A görbe exponenciális fázisának meredeksége egyenesen arányos az erősítési hatásfokkal, minél nagyobb a meredekség, annál nagyobb az erősítési hatásfok.
C: A standard alapvonal lapos vagy enyhén csökkenő, látható felfelé irányuló tendencia nélkül.
D: Az egyes csövek amplifikációs görbéinek párhuzamossága jó, ami azt jelzi, hogy az egyes reakciócsövek amplifikációs hatékonysága hasonló.
5. Olvadási görbe
Amikor a PCR-terméket melegítjük, a hőmérséklet emelkedésével a kétszálú amplifikációs termék fokozatosan disszociál, ami a fluoreszcencia intenzitásának csökkenését eredményezi. Egy bizonyos hőmérséklet elérésekor nagy mennyiségű termék válik le, ami a fluoreszcencia éles csökkenését eredményezi. Ennek a funkciónak a különböző PCR-termékek eltérő TM-értékeivel együtt történő használata abban is különbözik, hogy milyen hőmérsékleten csökken a fluoreszcens jel gyorsan, ami jó módszer lehet a PCR-specifitás azonosítására.
6. Olvadási görbe (logaritmikus görbe használatával)
A csúcsgrafikont az olvadási görbe logaritmusa képezi, hogy intuitívabban jelenítse meg a termékdarabok helyzetét. Mivel az olvadási hőmérséklet egy DNS-fragmens TM-értéke, meghatározhatók bizonyos, a DNS-fragmentum TM-értékét befolyásoló paraméterek, mint például a fragmentum mérete, a GC-tartalom stb. Általánosságban elmondható, hogy a primer tervezési elvünk szerint általában azt mondják, hogy hogy az amplifikált termék hossza a 80-300bp tartományba essen, és az olvadási hőmérséklet 80 fok és 90 fok között legyen.
V: Ha csak egy fő csúcs van 80 fok és 90 fok között, az azt jelenti, hogy a valós idejű PCR tökéletes.
B: Ha a főcsúcs 80 fok és 90 fok között, a szennyezőcsúcs pedig 80 fok alatt jelenik meg, akkor alapvetően a primer-dimert vesszük figyelembe. Ez egy jó lehetőség, hogy megpróbálja megoldani a hőkezelési hőmérséklet emelésével.
C: Ha a főcsúcs 80 és 90 fok között jelenik meg, és egy vándorcsúcs a hőmérséklet emelkedésével, akkor alapvetően DNS-szennyeződésről van szó. A DNS-t pedig a kísérlet kezdeti szakaszában el kell távolítani.
7. Szabványos görbe vonal
A standard standardokat különböző koncentrációkra hígítottuk, és templátként használtuk a PCR-reakciókhoz. A standard görbét a standard másolatszám logaritmusával abszcisszaként, a mért CT-értéket pedig az ordinátaként ábrázoljuk. Ismeretlen minta számszerűsítésekor az ismeretlen minta CT-értéke alapján a standard görbéből kaphatjuk meg a minta másolatszámát. A standard görbék nagyon fontosak az abszolút számszerűsítéshez.
a második rész. gyakori probléma
1. kérdés: Mi a különbség az RT-PCR, a QPCR, a valós idejű PCR és a valós idejű RT-PCR között?
A1: Az RT-PCR egy reverz transzkripciós PCR, amely a polimeráz láncreakció széles körben használt változata. Az RT-PCR során az RNS-szálat reverz transzkripcióval komplementer DNS-vé írják át, amelyet aztán templátként használnak a PCR-hez a DNS PCR-rel történő amplifikálásához.
A valós idejű PCR és a QPCR ugyanaz, mindkettő valós idejű kvantitatív PCR, ami azt jelenti, hogy a PCR folyamat során minden ciklusban valós idejű adatrögzítés történik. Ily módon az indítási sablonok száma pontosan elemezhető.
Bár úgy tűnik, hogy mind a valós idejű PCR, mind a reverz transzkripciós PCR rövidítése RT-PCR, a nemzetközi konvenció szerint az RT-PCR kifejezetten a reverz transzkripciós PCR-re vonatkozik, míg a valós idejű PCR-t gyakran qPCR-nek (Quantitative Real-) rövidítik. True Real-True Real PCR ) - idő PCR).
A valós idejű RT-PCR (RT-QPCR) a reverz transzkripciós PCR egy olyan típusa, amely egyesíti a fluoreszcens kvantitatív technikákat: először az RNS-ből történő reverz transzkripciót cDNS (RT) nyeréséhez, majd kvantitatív elemzést valós idejű PCR (QPCR) alkalmazásával.
2. kérdés: Miért van a fluoreszcens kvantitatív PCR amplifikált termékfragmensének hossza 80-300 bp tartományon belül szabályozva?
A2: Az egyes génszekvenciák hossza eltérő, némelyikük több Kb és több száz BP. A primer megtervezésekor azonban csak azt kell megkövetelnünk, hogy a termék hossza 80-300 bp legyen, és a túl rövid vagy túl hosszú nem alkalmas kvantitatív PCR kimutatásra.
A termékfragmensek túl rövidek ahhoz, hogy meg lehessen különböztetni a primer-dimerektől. A primer-dimer hossza kb. 30-40bp, ha 80 bp-nál kisebb, akkor nehéz megkülönböztetni, hogy primer-dimerről vagy termékről van szó. Ha a termék fragmentum túl hosszú, meghaladja a 300 bp-t, az könnyen alacsony amplifikációs hatékonysághoz vezet, és a gén mennyiségét nem lehet hatékonyan kimutatni.
Például, amikor megszámolja az osztályteremben tartózkodó emberek számát, csak azt kell megszámolnia, hogy hány száj van. Ugyanez igaz a gének tesztelésére is. Csak a gén egy bizonyos szekvenciáját kell kimutatnia ahhoz, hogy a teljes szekvenciát reprezentálja. Könnyű hibázni, ha a szájat és az orrot, a füleket és a szemüveget is számolod az emberek megszámlálásához.
3. kérdés: Mi az optimális hossza az alapozó kialakításához?
3. válasz: Általánosságban elmondható, hogy a 20-24bp tartományba eső primer hossza jó. Természetesen az alapozó tervezésekor ügyelnünk kell az alapozó TM értékére, mert ez összefügg az optimális lágyítási hőmérséklettel. Sok kísérlet után bebizonyosodott, hogy a 60 fok jó TM érték. Az alacsony hőkezelési hőmérséklet könnyen nem specifikus amplifikációhoz vezethet, míg a magas lágyítási hőmérséklet általában alacsony amplifikációs hatékonysághoz, az amplifikációs görbe késői csúcsához és késleltetett CT-értékhez vezet.
4. kérdés: Befolyásolja-e a begyűjtött minta mennyisége a kísérleti eredményeket?
A4: Nem. Nyilvánvaló, hogy minél több mintát gyűjtünk, minél több RNS-t vonunk ki, annál több cDNS és annál több célfragmens lesz. Az abszolút kvantifikáláshoz szükséges a céltöredék kópiaszámának kiszámítása, és a begyűjtött minta mennyisége mindenképpen befolyásolja a kísérleti eredményeket. Például a hepatitis C vírus HBV kimutatása a vérben a HBV-tartalom kimutatása bizonyos mennyiségű (1 ml) vérben.
A tudományos kutatásban általánosan használt relatív kvantifikációnál a minták számának semmi köze a kísérleti eredményekhez, mert a relatív kvantifikáció a célgén és a referenciagén összehasonlítását jelenti. Csak kérjük, tekintse őket felfelé és lefelé irányuló fragmentumoknak, amelyek ugyanabban a nukleinsavszálban jelen vannak. Ha a minta nagy, akkor a referencia- és a célgének egyidejűleg azonos arányban növekednek, ami nem befolyásolja az eredményeket.
5. kérdés: Befolyásolja-e a reverz transzkriptáz hatékonysága a kísérleti eredményeket?
A5: Ugyanaz, mint fent. Megjegyezzük, hogy nagyobb RT-hatékonyságot szeretnénk, de azt szeretnénk, ha az RT enzim viszonylag stabil legyen, és egyenletes eredményeket kapjon. Ez a nagyvállalatok fordított átírási csomagjainak optimalizált képességeinek tesztje lesz.
6. kérdés: Befolyásolja-e a TAQ enzim hatékonysága a kísérleti eredményeket?
A6: A TAQ enzim hatékonysága viszonylag nagy. Jellemzően hot-start taq enzimekre van szükség, és ezek viszonylag hatékonyak. A kereskedelmi forgalomban kapható fluoreszcens kvantitatív készleteknél minden gyártó a saját termékei szerint a legjobb állapot hatásfokát közel 100 százalékra optimalizálja, ha túl alacsony a hatásfok, a kísérleti eredmények nem érhetők el. A különböző cégek termékeinél ez a minőség mértéke.
7. kérdés: Befolyásolja-e a fluoreszcens festék mennyisége a kísérleti eredményeket?
A7: Igen, lesz. Ha a fluorokróm túl telített, az zavart okozhat egyes műszerekben. Ha a fluorokróm nem telített, és a fluoreszcencia értéke túl alacsony, akkor korán platófázisba lép, és az amplifikációs görbe lapos lesz. A fluoreszcencia kvantitatív kísérletben elsősorban a CT értéket látjuk, így nem fontos, hogy a késői amplifikációs görbe platóstádiumba kerüljön, de a kép nem elég szép. Ha választania kellett, kezdje azzal, hogy valamivel kevésbé telített fluorokrómot válasszon. Ugyanazon cég ugyanazon termékének használata esetén azonban annak hatása alapvetően elhanyagolható.
8. kérdés: Befolyásolja-e a PCR-cső átvitele a kísérleti eredményeket?
A8: Igen. Az ugyanattól a gyártótól származó fogyóeszközök esetében azonban ez a hatás figyelmen kívül hagyható. Ez egy jó választás, és a legjobb, ha nagy áteresztőképességű membránnal ellátott 96-lyuklemezt használ, hogy minimalizálja a fogyóeszközök fényáteresztő képességének hatását.
9. kérdés: A működés közben fellépő hibák hatással lesznek a kísérleti eredményekre?
A9: A működési folyamat hatása elsősorban az egységességben mutatkozik meg. A homogenitás azt jelenti, hogy a rendszer minden komponense egyenletesen keveredik egymással, és a flash centrifugálás megoldhatja ezt a problémát. Ezenkívül a kezdők számára a legjobb, ha a PCR-rendszert 20 hüvelyknél nagyobbra állítják be, és a túl kicsi rendszer hajlamosabb a hibákra. Ha a lágyítási hőmérséklet megfelelően van optimalizálva, a primer koncentrációjának a CT-re gyakorolt hatása minimálisra csökken. És tudni fogja, hogy néhány működési hiba (például a primer koncentrációja) elkerülhető a lágyítási hőmérséklet optimalizálásával.
Összesít
A fenti néhány olyan kérdés és kérdés, amelyekkel a kezdők gyakran találkoznak a kísérlet során, reméljük, hogy ezek a kérdések segíthetnek megoldani a zavart. A kísérletezés a káosz generálásának és a problémák megoldásának folyamata, remélhetőleg kihoznak belőle valamit. Köszönjük, hogy elolvasta, és legközelebb találkozunk!
