Mi az a sejtkultúra?
sejtkultúra
A sejttenyésztés a sejtek termesztésének folyamatát jelenti, ellenőrzött körülmények között a természetes környezetükön kívül. Ez egy in vitro eszköz, amely megkönnyíti a sejtbiológia és a betegségek mechanizmusainak megértését. Szerepet játszik a gyógyszerkutatásban is, például a gyógyszertoxicitási vizsgálatokban és a farmakokinetikai/farmakodinamikai vizsgálatokban, valamint a személyre szabott orvoslásban.
Ross Granville Harrison amerikai embriológus a 20. század elején dolgozta ki az első in vitro sejttenyésztési technikákat, amikor sikeresen növesztette ki a békaembriókból in vitro szövetdarabokat. Napjainkban a sejtkultúra számtalan felfedezést segített, mint például a gyermekbénulás, a kanyaró, a mumpsz és más fertőző betegségek elleni vakcinák kifejlesztését.
Tapadás és felfüggesztés kultúra
A sejtnövekedéshez két alapvető rendszer létezik: a tapadó tenyészet és a szuszpenziós tenyészet. A tapadó tenyészeteket mesterséges szubsztrátokon növesztjük, míg a szuszpenziós tenyészetekben a sejtek szabadon lebegnek a tápközegben. Míg csak néhány sejttípus szaporodik természetes módon szuszpenzióban (pl. limfociták), sok adherens sejttípus adaptálható szuszpenziós tenyészethez.
A természetesen tapadó sejtek szuszpenzióban való tenyésztésének két oka van. A szuszpenziós tenyésztés első előnye, hogy a sejtek könnyebben passzálhatók, mivel nem kell enzimatikusan vagy mechanikusan leválasztani őket a tenyészedényről. Másodszor, a szuszpenziós tenyészeteket könnyebb méretezni, mivel a sejtnövekedést csak a tápközegben való koncentrációjuk korlátozza, a rendelkezésre álló felület nem. A szuszpenziós tenyészetek fő hátránya, hogy napi sejtszámlálást és életképességi vizsgálatot igényelnek a növekedési minták követéséhez, míg a tapadó tenyészetek mikroszkóp alatt könnyen megvizsgálhatók.
2D és 3D módszerek
A tapadó tenyészetek tovább oszthatók 2D és 3D tenyészetekre. A 2D alkalmazásokban a tapadó sejteket egyrétegű rendszerben, sík felületen, például sejttenyésztő lombikban növesztik.
sejtkultúra
A 2D technológia egyszerűsége miatt nem képes utánozni a sejtek in vivo környezetét, amelyek jellemzően háromdimenziós struktúrákban nőnek, összetett sejt-sejt kölcsönhatásokkal. Ez az oka annak, hogy néhány kísérletet 3D kultúrákkal végeznek, amelyek állvány alapú vagy állvány nélküli technológiákkal termeszthetők.
Az állvány alapú 3D módszerek jellemzően a tapadó sejteket hidrogél állványokban növesztik. Bizonyos alkalmazásokhoz olyan alternatívákat is alkalmaznak, mint a biokerámia, fém vagy polimer állványok.
Állványmentes technikákat használnak a szferoidok termesztésére a három különböző módszer egyikével:
Forced Float: Töltse be a sejtszuszpenziót egy alacsony tapadású polimerrel bevont mikrolemez üregeibe. A mikrolemezt ezután centrifugálják, hogy a sejteket szferoidok képzésére kényszerítsék.
Lógó csepp: A sejtszuszpenziót egy függő csepplemez lyukaiba töltjük. Ahogy a neve is sugallja, a szuszpenzió cseppekként fog lógni a lemezen. A sejtek ezeknek a cseppeknek a csúcsán aggregálódnak, és gömböket alkotnak.
Keverés alapú: A sejtszuszpenziót egy forgó bioreaktorba helyezzük. Az állandó keverés miatt a sejtek nem tudtak megtapadni a falakon, így gömböcskék alakultak ki.
Sejtkultúra Kihívás
A módszerek és technikák közötti különbségek ellenére minden kísérletben közös: nehéz a reprodukálható eredmények eléréséhez szükséges számú élő sejtet szaporítani. Ezért a következő részeket négy kihívásnak szenteljük – az ismételhetőség, a szennyeződés, a megvalósíthatóság és az automatizálásra való átállás.
reprodukálhatóság
A Yongyue Medical felmérése szerint a tudósok több mint 70 százaléka arról számolt be, hogy nem sikerült reprodukálnia egy másik tudós kísérleteit, és több mint felének nem sikerült reprodukálnia saját munkáját. A sejttenyésztési vizsgálatok során a legtöbb reprodukálhatósági probléma a sejtpasszálások vagy -generációk közötti biológiai különbségekből adódik. Egy másik nagy probléma a sejtvonalak téves azonosítása, és a tenyésztési paraméterek következetlenségei is fontos szerepet játszanak.
biológiai variáció
Az olyan tényezők, mint a véletlenszerű mutációk vagy az átírási hibák, befolyásolhatják a kísérletek reprodukálhatóságát minden egyes sejtosztódáskor. Ennek elkerülése érdekében egy új projekt elején hozzon létre egy cellabankot.
sejtbank
A sejtbankkezelés azt a folyamatot jelenti, amelyben meghatározott sejttípusok kötegeit tárolják későbbi felhasználás céljából, hogy elkerüljék a reprodukálhatóságot befolyásoló tényezőket, például véletlenszerű mutációkat vagy átírási hibákat. Az első lépés egy mestersejtbank (MBC) létrehozása a kiválasztott sejttípusok tenyésztése és több tárolóedényben való mélyhűtése révén. Az MBC tételeket felolvasztják, és később munkasejtbankok (WBC) előállítására használják fel.
A sejtvonalak téves azonosítása
A sejtvonal téves azonosításának problémája az 1960-as évek óta ismert, amikor egy tudós 19 másik emberi sejtvonal HeLa-sejt-szennyeződését írta le. Annak érdekében, hogy eredményei megbízhatóak legyenek, és ami még fontosabb, hogy ne vonjon le téves következtetéseket, karanténba kell helyeznie a laboratóriumba kerülő új sejtvonalakat mindaddig, amíg az eredetüket meg nem igazolják. A legfontosabb, hogy a sejtvonal minősítését a mélyhűtést megelőzően és más laboratóriumokba való kiosztás előtt, valamint a projekt befejezése után javasolt megismételni. Egy sejtvonal ellenőrzéséhez először ellenőrizze, hogy az szerepel-e a rosszul azonosított sejtvonal-nyilvántartásban. Ha nincs regisztrálva, akkor is meg kell erősítenie a hitelességét. Humán sejtvonalak esetében rövid tandem ismétlés (STR) analízis (DNS ujjlenyomat) javasolt. Különféle vizsgálati módszerek állnak rendelkezésre nem humán sejtvonalakhoz, beleértve a kariotipizálást, az izoenzim-analízist és a mitokondriális DNS tipizálást (DNS vonalkódolás).
Kultúra paraméterei
A reprodukálhatóságot befolyásoló harmadik tényező a tenyésztési paraméterek.
Például az oxigénszint jelentősen befolyásolhatja a tenyésztett sejteket. Az oxigenizációt befolyásoló változók, például a kamra mérete vagy a sejtsűrűség azonban nem mindig vannak dokumentálva, ezért nem tarthatók konzisztensek.
Egy másik fontos tenyésztési paraméter a táptalaj. Ez biztosítja az alapvető tápanyagokat, növekedési faktorokat és hormonokat, valamint szabályozza a pH-t és az ozmotikus nyomást. Ezért a legfontosabb, hogy az összetétele mindig ugyanaz. Ez különösen kritikus a borjúmagzati szérummal (FBS) kiegészített tápközegek esetében, amelyek összetétele olyan tényezőktől függ, mint a tehén étrendje, földrajzi elhelyezkedése és az évszak. Az FBS-nek az eredmények reprodukálhatóságára gyakorolt hatásának minimalizálása érdekében rendeljen különböző szérumtételeket, amikor a jelenlegi készletek kezdenek kifogyni, és tesztelje azokat, hogy megtalálja a legközelebbi egyezést. Annak érdekében, hogy mások reprodukálhassák az eredményeit, jelentse, hogyan szűrte le a szérumot, és rögzítse a tételszámot.
sejtkultúra
Sejtfeldolgozás
A legtöbb kutató tudja, hogy a tenyésztési paraméterek óriási hatással vannak az alkalmazásukra, de a feldolgozási technikák változásait gyakran figyelmen kívül hagyják.
Környezetszennyezés
Amikor a sejteket izolálják a szövetből, és a laboratóriumban növesztik, már nem védi őket az immunrendszer, ezért rendkívül érzékenyek a fertőzésekre.
A szennyeződés első forrása az abiotikus szennyeződések, mint például a táptalajban, szérumban, kiegészítőkben vagy vízben lévő szennyeződések, valamint endotoxinok és kioldódó anyagok. Az óvintézkedések közé tartozik a laboratóriumi minőségű víz használata sejttenyésztési kísérletekhez, valamint táptalajok, szérumok, kiegészítők és fogyóeszközök olyan gyártóktól, amelyek endotoxin vizsgálati tanúsítványt kínálnak. Ezenkívül a fogyóeszközöknek szűz polisztirolból vagy polipropilénből kell készülniük, hogy a műanyag adalékanyagok ne szivárogjanak be a sejttenyészetbe.
A második szennyeződési forrás a biológiai szennyeződések, például baktériumok (beleértve a mikoplazmát), gombák és élesztőgombák.
megvalósíthatósága
A sejtek életképességét az életképes sejtek arányaként határozzuk meg a mintában. Az imént látott szennyeződéseken kívül számos egyéb tényező is befolyásolja a sejtek életképességét. A környezeti feltételek – a hőmérséklet, a pH, az ozmotikus nyomás, a tápanyagok elérhetősége, valamint az O2- és CO2-koncentráció – nagyon fontosak. Ezen változók többségét a táptalaj szabályozza, és sejttípus-specifikusak, ami sajnos azt jelenti, hogy nem tudunk konkrét iránymutatást adni.
Mivel a sejtek nagyon érzékenyek a nyomásra, nem csak a környezeti feltételekre kell figyelni, hanem a folyadékkezelési technikákra is.
A sejtek életképességét befolyásoló utolsó tényező az öregedés. A legtöbb véges sejtvonal 20-60 osztódást túlél, mielőtt elpusztulna, ami azt jelenti, hogy csak 15 és 45 generáció között lehet újra felhasználni. Ezt követően a mélyhűtött mintát ki kell olvasztani a sejtbankból. A folyamatos sejtvonalak korlátlan ideig szaporodhatnak, de mivel hajlamosak a genetikai sodródásra, rendszeresen cserélni kell őket.
A sejtek életképességének mérésére kolorimetriás, fluorometrikus és biolumineszcens módszereket alkalmazó kimutatási vizsgálatok használhatók. Egy általánosan alkalmazott kolorimetriás módszer az MTT módszer, amely a sárga tetrazólium sók élő sejtek által lila formázán kristályokká történő redukálásán alapul.
96-kúttányérok
automatizálás
A fent leírt kihívások közül sok megoldható a sejttenyésztési munkafolyamatok automatizálásával. Például a sejtkezelés mindig következetes lesz, ami pozitívan befolyásolja a reprodukálhatóságot és az életképességet. A legfontosabb, hogy az automatizálás csökkenti a felhasználó szennyeződésének kockázatát.
Ezen előnyök ellenére a teljes munkafolyamatok automatizálása kihívást jelenthet költségvetési okok, a robotok számára való helyhiány miatt, vagy azért, mert nincs elegendő erőforrás az egyes lépések egyidejű automatizálásához és érvényesítéséhez. De ez megoldható!
