A PCR-technológiának mesterségesen szintetizált ésszerű primerekkel és kivont DNS-mintával kell rendelkeznie, majd automatikus hőciklust kell végrehajtania, végül pedig termékazonosítást és elemzést kell végeznie. A primer tervezés és szintézis jelenleg csak néhány erős műszaki erővel rendelkező kutatóintézetben, intézetben, klinikán végezhető. Az alkalmazásnak csak a PCR-detektáló készletet kell megvásárolnia a munka megkezdéséhez. A PCR automatikus termikus ciklusában számos befolyásoló tényező van. Különböző DNS-minták esetén a PCR-reakcióban hozzáadott különböző komponensek mennyisége és a hőmérsékleti ciklus paraméterei nem következetesek.
Számos fő befolyásoló tényezőt mutatunk be az alábbiak szerint.
Egy, a hőmérsékleti ciklus paraméterei
A PCR automatikus termikus ciklusban a legkritikusabb tényező a denaturálás és a lágyítás hőmérséklete. Amint az a műveleti példában látható, a denaturálás, az összeillesztés és az extenzió feltételei: 94℃60s, 37℃60s, 72℃120s, összesen 25℃30 A ciklus, az amplifikált fragmentum 500 bp. Itt az egyes lépések idejét azután kell kiszámítani, hogy a reakcióelegy elérte a kívánt hőmérsékletet. Az automata hőciklusban a keverék eredeti hőmérsékletétől a kívánt hőmérsékletig tartó idő 30-60 mp. Ennek a késleltetési időnek a hossza számos tényezőtől függ, többek között a reakciócső típusától, falvastagságától, a reakcióelegy térfogatától, hőtől. forrás (vízfürdő vagy fűtőblokk), valamint a két lépés közötti hőmérséklet-különbség, amelyet megfelelően biztosítani kell a termikus ciklus beállításakor Figyeljen és vegye figyelembe, és minden műszeren tényleges mérést kell végezni.
Egy másik fontos szempont a termikus ciklusidővel kapcsolatban a két primer közötti távolság; minél nagyobb a távolság, annál tovább tart a célszekvencia teljes hosszának szintetizálása. A fent megadott reakcióidő az 500 bp optimális szintézishosszon alapul. A célszekvencia összeállításra kerül. Íme egy bevezető a különböző hőmérsékletek kiválasztásához.
1. Templát denaturációs hőmérséklet A denaturációs hőmérséklet határozza meg azt a hőmérsékletet, amelyen a kettős szálú DNS megolvad a PCR reakcióban. Ha a denaturációs hőmérsékletet nem éri el, nem képződik egyszálú DNS-templát, és a PCR nem indul el. Az alacsony denaturációs hőmérséklet tökéletlen denaturációt jelent, a DNS kétszálú. Gyorsan renaturálódik, így csökken a hozam. Általában 90-95 ℃. Amint a minta elérte ezt a hőmérsékletet, gyorsan le kell hűteni az izzítási hőmérsékletre. A DNS denaturálása csak néhány másodpercet vesz igénybe, és nem szükséges sokáig; éppen ellenkezőleg, meg kell próbálnia a legjobbat magas hőmérsékleten. Rövidítse le, hogy fenntartsa a Taq DNS polimeráz aktivitását. A maximális denaturációs hőmérséklet a Taq DNS polimeráz hozzáadása után nem haladhatja meg a 95 °C-ot.
2. A primer lágyítási hőmérséklete Az annealing hőmérséklet határozza meg a PCR specificitását és hozamát; ha a hőmérséklet magas, akkor a specificitás erős, de ha a hőmérséklet túl magas, a primer nem kapcsolódhat szilárdan a templáthoz, és csökken a DNS-amplifikációs hatékonyság; a hőmérséklet alacsony, a hozam magas, de a túl alacsony alapozó és sablon eltérést okozhat, A nem specifikus termékek nőnek. Általában kezdje a 37 ℃-os reakciókörülményeket, és állítson be egy sor kontroll reakciót, hogy meghatározza egy adott reakcióhoz az optimális lágyítási hőmérsékletet. A primerek (G+C)%-os tartalma alapján is kikövetkeztethető a teszt megértéséhez. Az általános vizsgálat kiindulópontja, a Ta (hevítési hőmérséklet) 5℃-kal alacsonyabb, mint az olvadási hőmérséklet. Az amplifikációs primer TTm (olvadási hőmérséklete), amely a következő képlet szerint számítható ki:
Ta = Tm-5℃=4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
Közülük A, T, G és C a megfelelő bázisok számát jelenti. Például egy 20 bázisos primernél, ha a (G+C)% tartalom 50%, a Ta kiindulási pontja 55°C-ra állítható. Egy tipikus primer koncentrációnál (például 0,2 μmol/L) az annealing reakció néhány másodperc alatt befejeződik, és nincs szükség hosszú távú annealingra.
3. A primer kiterjesztési hőmérséklet megválasztása a Taq DNS polimeráz optimális hőmérsékletétől függ. Általában 70–75 °C-on, az enzimkatalizált nukleotidok standard sebessége 72 °C-on elérheti a 35–100 nukleotid/sec értéket. percenként. 1kb hossza meghosszabbítható, sebessége a pufferoldat összetételétől, pH-értékétől, sókoncentrációjától és a DNS templát természetétől függ. Ha az amplifikált fragmens 150 bp-nál rövidebb, a kiterjesztési lépés elhagyható, és kettős hőmérsékletű ciklussá válik, a Taq DNS miatt. A polimeráz elegendő a rövid szekvenciák szintézisének befejezéséhez az annealing hőmérsékleten. A 100 és 300 bp közötti rövid szekvenciájú fragmentumok esetében hatékony a gyors és egyszerű kettős hőmérsékletű ciklus alkalmazása. Ekkor a primer kiterjesztési hőmérséklete megegyezik a lágyítási hőmérséklettel. Az 1 kb-nál nagyobb DNS-fragmensek esetében a meghosszabbítási idő 1-7 percen belül szabályozható a fragmentum hosszától függően. Ezzel egyidejűleg zselatint vagy BSA-reagenst kell hozzáadni a PCR-pufferhez, hogy a Taq DNS-polimeráz hosszú ideig aktív és stabil maradjon. Szex; A 15–20% glicerin segít körülbelül 2,5 kb-os vagy hosszabb DNS-fragmensek amplifikálásában.
4. A hagyományos PCR ciklusainak száma általában 25-40 ciklus. Az általános hiba az, hogy túl sok a ciklusszám, súlyos a nem specifikus háttér, és nő a bonyolultság. Természetesen a reakcióciklusok száma túl kicsi, és a hozam is alacsony. Ezért biztosítani kell a termék megszerzését. A sebesség előfeltétele szerint a ciklusok számát minimálisra kell csökkenteni.
Az amplifikáció befejezése után a mintát lehűtjük és 4 °C-on tároljuk.
2. Primer Primer Design
A templát DNS amplifikálásához először meg kell terveznie két oligonukleotid primert. Az úgynevezett primerek valójában két oligonukleotid-fragmens, amelyek komplementerek az amplifikálandó cél-DNS-szekvenciával. A két primer közötti távolság határozza meg az amplifikált fragmens hosszát. , A két primer 5'vége határozza meg az amplifikált termék két 5'végének helyzetét. Látható, hogy a primerek jelentik a kulcsot a PCR-rel amplifikált fragmensek hosszának, helyzetének és eredményeinek meghatározásában, és a primer tervezése sokkal fontosabb.
A primer tervezésének szükséges feltétele, hogy ismerni kell a primerrel komplementer cél DNS-szekvenciát. A két primer közötti sorrend nem feltétlenül egyértelmű. A két ismert szekvencia általában 15-20 bázisból áll, amelyek DNS szintetizátorral szintetizálhatók. A két komplementer primernek megfelelően a primer tervezésénél általában követett elvek a következők:
1. A primer hosszát statisztikai adatok alapján számítjuk ki, és annak a valószínűsége, hogy egy körülbelül 17 bázisból álló oligonukleotid szekvencia megjelenhet a humán genomban, egyszer. Ezért a primer hossza általában nem kevesebb, mint 16 nukleotid, a legmagasabb pedig legfeljebb 30 nukleotid, a legjobb hossza pedig 20-24 nukleotid. Az ilyen rövid oligonukleotidok nem képeznek stabil hibridet a polimerizációs hőmérsékleten (72 °C felett). Néha lehet 5' Adjon hozzá olyan szekvenciákat, amelyek nem komplementerek a templáttal a végén, például restrikciós enzimhelyeket vagy promótereket a génklónozás befejezéséhez és más speciális igényekhez; a primer 5'end biotin jelölő vagy fluoreszcens jelölés különféle célokra használható, például mikrobiális kimutatásra.
Néha az alapozó nem működik' az ok ismeretlen, a helyzet mozgatásával megoldhatja.
2. A (G+C)% tartalmú primerek összetételének egységesnek kell lennie, és igyekezni kell elkerülni, hogy ugyanazt az alappolimert tartalmazzák. A két primerben a (G+C)% tartalomnak a lehető leghasonlóbbnak kell lennie, az ismert amplifikált fragmensben (G+C) a %-os tartalomnak közel kell lennie az amplifikálandó fragmentumhoz, általában 40-60% jobb.
3. Az alapozó belsejében kerülni kell a nyilvánvaló másodlagos struktúrák, különösen a hajtűs szerkezetek kialakulását. Például:
4. A két primer között nem lehet komplementáció a primerek között, különösen a primer 3'végén. Még ha nem is kerülhető el, a 3'végű komplementer bázis nem lehet nagyobb 2 bázisnál, különben könnyen lehet"primer dimer" Vagy"Primer dimer" (Primer dimer). Az úgynevezett primer dimer lényegében egy kettős szálú DNS-fragmens, amely az egyik primernek a másik primerszekvencián való kiterjesztésével, DNS-polimeráz hatására jön létre. , A PCR gyakori mellékterméke, és néha a fő termékké is válik.
Ezenkívül kerülje a homológ szekvenciákat a két primer között, különösen a több mint 6 egymást követő azonos bázist tartalmazó oligonukleotid fragmenseket, különben a két primer verseng egymással a templát ugyanazon helyéért; hasonlóképpen a primerek és az amplifikálandó cél DNS vagy a minta DNS más szekvenciái nem rendelkezhetnek 6 bázisnál több homológ szekvenciával. Ellenkező esetben a primerek más helyekhez kötődnek, csökkentve a specifikus amplifikációt és növelve a nem specifikus amplifikációt.
5. A 3. primer'végpárosító DNS-polimeráz egyetlen nukleotidot ad a primer 3'végéhez. Ezért a primer 3'végétől számított 5-6 bázis és a cél DNS párosítási követelményeinek pontosnak és szigorúnak kell lenniük, hogy biztosítsák a hatékony PCR-amplifikációt. .
Azt, hogy az alapozó kialakítása ésszerű-e, számítógépes kereséssel ellenőrizhető PCRDESN szoftver és amerikai PRIMER szoftver segítségével.
A mesterségesen szintetizált oligonukleotidokat előnyösen kromatográfiával (kromatográfiával) vagy PAGE-val kell tisztítani, hogy eltávolítsuk a szennyeződéseket, például a rövid láncokat, amelyeket nem szintetizáltak teljes hosszúságban. A 25%-os acetonitril-oldatban 4°C-on tárolt tisztított primerek megakadályozhatják a mikroorganizmusokat Normál körülmények között a fel nem használt primereket hűtőszekrényben kell tárolni -20°C-on. A primerek folyadékban 6 hónapig, liofilizálás után 1-2 évig tárolhatók.