1. Sejt helyreállítás
Miután a mélyhűtött sejteket eltávolítottuk a folyékony nitrogénből, 37 fokos vízfürdőben folyamatos rázatás mellett felengedtük. Tegye át a felolvasztott sejteket egy centrifugacsőbe, adjon hozzá 37 fokra előmelegített DMEM komplett táptalajt (amelynek a magzati szarvasmarha-szérum körülbelül 10 százaléka), finoman fújja egyenletesen, centrifugálja 500 g-vel 2 percig, és dobja ki a felülúszót.
Adjon hozzá DMEM komplett tápközeget a mosáshoz, és dobja ki a felülúszót. Adjunk hozzá DMEM komplett tápközeget, óvatosan keverjük össze pipettával, készítsünk sejtszuszpenziót, oltsuk be Petri-csészébe/lombikba, és tenyésztsük 5 százalék CO2-t tartalmazó sejtinkubátorban.
2. Sejtpasszázs
Ha a sejtsűrűség eléri a 80-90 százalékot (a korai hozam nem elegendő, a túl késői sejtek rossz állapotban vannak, 1:2-1:10 arányban szubkultúrázzuk, általában 1:3-1:5 sejtgeneráció, azaz a sejtbeoltásból. Az elválasztás és az újratenyésztés időpontjában a teljes tápközeget eltávolítottuk, és kétszer mostuk 1X PBS-sel.
Adjunk hozzá tripszint (megjegyzés: az emésztőoldat mennyisége a legjobb, hogy ellepje a sejteket, és az optimális emésztési hőmérséklet 37 fok. A sejteket mikroszkóp alatt figyeljük meg: fordított mikroszkóp alatt figyeljük meg az emésztett sejteket, ha a citoplazma visszahúzódik, a sejteket már nem kapcsolódnak egymáshoz. Szeleteket, jelezve, hogy a sejtek jelenleg megfelelően emésztettek), megemészteni őket, és körülbelül 2-3 percre sejtinkubátorba helyezzük.
Adjunk hozzá megfelelő mennyiségű DMEM komplett tápközeget a tripszinezés leállításához, vigyük át egy centrifugacsőbe, és centrifugáljuk 500 g-vel 2 percig, öntsük el a felülúszót, adjunk hozzá DMEM komplett tápközeget a mosáshoz, és dobjuk ki a felülúszót.
Adjon hozzá DMEM komplett tápközeget, finom pipettával keverje össze, pipettázzon 10 mikrolitert a számláláshoz, majd folytassa a tenyésztést 5% CO2-t tartalmazó sejtinkubátorban a szükséges sejttérfogatnak megfelelően.
3. Sejtek mélyhűtése
Amikor a sejtsűrűség eléri a 80-90 százalékot, távolítsa el a teljes tápközeget, és mossa le kétszer 1X PBS-sel. Adjunk hozzá tripszint az emésztéshez, és helyezzük egy sejtinkubátorba körülbelül 2-3 percre. Adjunk hozzá DMEM komplett tápközeget a tripszin emésztés leállításához, vigyük át egy centrifugacsőbe, és centrifugáljuk 500 g-vel 2 percig, öntsük el a felülúszót, adjunk hozzá DMEM komplett tápközeget a mosáshoz, és dobjuk el a felülúszót. Adjunk hozzá 1 ml fagyasztóoldatot (90 százalék szarvasmarha-magzatszérum, 10 százalék DMSO. Általánosságban elmondható, hogy a szérumtartalom 10 százalék és 90 százalék között állítható. A szérum fagyasztóoldathoz való hozzáadása egyrészt tápanyagot biztosíthat a sejteknek, A sejtek mélyhűtése során biztosítson nem áteresztő védőanyagokat, például szacharózt, albumint stb., hogy jobban megvédje a sejteket, tegye mélyhűtő csőbe (a csőben izopropil-alkohol van, hogy biztosítsa a hőmérsékletcsökkentés sebességét), azonnal tegye be. Fagyassza le 4 fokos hűtőben 30 percre, majd tegyük -20 fokos hűtőbe 30 percre, majd tegyük egy éjszakára -80 fokos hűtőbe.
Másnap folyékony nitrogénbe tesszük, legalább két évig eláll, ha pedig nem folyékony nitrogénbe, akkor három hónapig is eláll.
A sejtek mélyhűtésének és visszanyerésének elve: lassú fagyasztás és felolvasztás, ami jobban elősegíti a sejt életképességének megőrzését. A sejtek védőanyag nélküli mélyhűtése intracelluláris jégkristályok képződését eredményezi, amelyek endogén mechanikai károsodást okoznak a sejtekben, változást okoznak az intracelluláris környezet ozmotikus nyomásában, pH-jában, elektrolitokban stb., majd elősegítik a sejthalált.
4. Figyelmet igénylő ügyek
(1) A tenyészoldat előmelegítése: a tenyészoldatot, PBS-t és tripszint tartalmazó előkészített palackot 37 fokos vízfürdőbe helyezzük előmelegítés céljából;
(2) 75 százalékos alkohollal törölje le az ultra-tiszta munkapadot és az ultraibolya sugárzással besugárzott kezeket;
(3) A használt műszerek helyes elhelyezése: elegendő üzemi teret kell biztosítani, amely nemcsak könnyen kezelhető, de a környezetszennyezést is csökkenti;
(4) Gyújtsa meg az alkohollámpát: vegye figyelembe, hogy a láng nem lehet túl kicsi;
(5) Szigorú aszeptikus működés;
(6) A tapadó sejtek mérsékelt emésztése: Az emésztési időt számos tényező befolyásolja, például az emésztőoldat típusa, az elkészítési idő és a tenyészlombikba adagolt mennyiség. Az emésztés során figyelni kell a tenyésztett sejtek alakváltozásaira. Ha a citoplazma összezsugorodik, ha a kapcsolat meglazul, vagy a darabokban való lebegtetés jelei vannak, az emésztést azonnal le kell állítani;
(7) Az áthaladott cellákon végzett minden műveletnek a lehető legközelebb kell lennie az alkohollámpa lángjához. A legjobb, ha egyszerre csak egy cellával dolgozunk, minden cellához egy-egy berendezést használunk. kerülje a keresztfertőzést;
(8) Az áthaladott cella palack száját minden kinyitáskor vagy bezáráskor alkohollámpán sterilizálni kell.
